Методы изучения клетки [исследования]

Главная особенность морфо­функционального метода к изучению клетки — стремление по­нять структурную основу биохимических процессов, определяю­щих данную функцию, т. е. связать эти процессы с конкретными клеточными структурами.

Конечная цель при таком методе идентична цели, пресле­дуемой молекулярной биологией и клеточной структурной био­химией. Однако методы, используемые этими науками для ре­шения общей задачи, принципиально различны. Если в моле­кулярной биологии и структурной биохимии непременным усло­вием является разрушение клетки и выделение изучаемой струк­туры в виде более или менее чистой фракции, то в цитологиче­ских исследованиях предпосылкой, наоборот, служит сохране­ние целостности клетки. В данном случае необходимо стре­миться к тому, чтобы свести внешнее вмешательство до мини­мума, и стараться исследовать структурно-биохимическую орга­низацию тех или иных компонентов именно в пределах целост­ной клеточной системы.

Исследования морфофункционального направления бурно развивались в течение последних десятилетий. В это время было разработано большое количество принципиально новых методов качественного и количественного анализа клеточных структур. Такой подход тесно связан с новыми разделами био­логических наук и, в частности, с молекулярной биологией, что и обусловливает весьма значительный вклад подобных иссле­дований в прогресс наших знаний об общих закономерностях организации клетки.

Электронная микроскопия

Одним из наиболее распространенных, ставшим классиче­ским методом, применяемым при структурно-биохимических исследованиях, является метод электронной микроскопии в раз­личных его модификациях. Эти модификации обусловлены как различными подходами к анализу изучаемых структур, так и особенностями подготовки клеток для ультраструктурных ис­следований. Высокие разрешения обычных трансмиссионных (просвечивающих) микроскопов позволяют анализировать не только все органоиды ядерного и цитоплазматического аппара­тов, но и некоторые структуры, находящиеся на надмолекуляр­ном уровне организации, например опорные и сократимые мик­рофибриллы, микротрубочки, некоторые мультиэнзимные ком­плексы. В настоящее время для исследования клеток на систем­ном и субсистемном уровнях их организации все чаще с успе­хом применяется метод высоковольтной электронной микроско­пии. Благодаря намного большей по сравнению с просвечиваю­щим электронным микроскопом энергии проникающего пучка электронов этот метод позволяет изучать под микроскопом «толстые» срезы или даже целые распластанные клетки, что позволяет, например, анализировать в целом сложную систему субмембранных фибрилл поверхностного аппарата клетки.

В исследовании функции поверхностного аппарата клетки, взаимосвязи отдельных субсистем поверхностного аппарата ядра и ряда других вопросов общей цитологии существенное значение приобретает метод сканирующей электронной микро­скопии, дающий возможность объемного изучения поверхности объекта.

Метод замораживания-скалывания

Особое и принципиально важное место в цитологиче­ских исследованиях морфобиохимического направления зани­мает метод замораживания-скалывания. Он является наибо­лее щадящим методом подготовки биологических объектов для ультраструктурного анализа, т. е. вызывает минимальные изме­нения клеточных структур по сравнению с их нативным состоя­нием. Суть метода заключается в следующем. Объект помещают в атмосферу жидкого азота, что моментально прекращает все метаболические процессы. Затем с замороженного объекта де­лают сколы. С поверхности сколов получают реплики путем нанесения на них металлической пленки. Эти пленки в дальней­шем исследуют под электронным микроскопом. Преимущество метода замораживания-скалывания заключается в том, что плоскость скола обычно проходит по гидрофобной фазе мем­браны, и это позволяет изучать на сколах количество, размеры и характер расположения интегральных белков мембраны, т. е. непосредственно внутреннюю морфобиохимическую организа­цию мембран. Метод дал очень ценные результаты при исследо­вании разного рода мембранных структур и специальных обра­зований, например некоторых типов клеточных контактов.

Цитохимический метод

Для основной задачи структурно-биохимического аспекта цитологических исследований — выяснения функционального значения структур через анализ их биохимической организа­ции-исключительно важную роль играют цитохимические ме­тоды. В настоящее время они непрерывно совершенствуются как в смысле точной качественной идентификации химических со­единений в изучаемых структурах, так и в смысле их количе­ственной оценки. С помощью специальных приборов, позволяю­щих проводить количественную цитоспектрофотометрию, можно определить содержание данного вещества, например РНК и ДНК, не только в клетке в целом, но и на уровне ядерных или цитоплазматических структур. Благодаря интерференционной микроскопии можно оценить общее количество белка в клетке и его изменения в процессе ее жизнедеятельности.

Существует метод цитохимической идентифи­кации ферментов, который позволяет судить не только о локализации и коли­честве того или иного соединения в клеточных структурах, но и о процессах синтеза и внутриклеточного транспорта этих соеди­нений.

Цитохимия ферментов основана на принципе субстрат-ферментного взаимодействия с использованием маркерных соеди­нений, выпадающих при этом в осадок. Определяя локализа­цию, а в некоторых случаях и активность ферментативных си­стем, мы можем судить о локализации тех или иных биохимиче­ских процессов в клеточных структурах.

Авторадиография

Метод авторадиографии, так же, как и цитохимия ферментов, открывает возможность исследования внутриклеточного синтеза и транспорта, но при этом имеет еще более широкие возможности. Метод автора­диографии основывается на использовании меченых искусственными изотопами (³Н, ¹⁴С, ³⁵S и др.) радиоактивных предшественников синтеза макромолекул. Он позволяет не только локализовать места син­теза тех или иных макромолекул, но и проследить конкретные пути внутриклеточного транспорта этих соединений, дать отно­сительную количественную оценку интенсивности синтеза и ско­рости перемещения макромолекул в клеточных структурах. Таким путем, в частности, было впервые показано перемещение РНК из ядра в цитоплазму клеток, детально прослежены лока­лизация синтеза и внутриклеточный транспорт секрета в секре­торных клетках и выявлены многие другие важные для общей цитологии факты. По своей сути этот метод — один из наиболее типичных методов, характерных для структурно-биохимического направления исследований, поскольку он позволяет непосред­ственно изучать процессы метаболизма во внутриклеточных структурах в целостной, неразрушенной (как в биохимических исследованиях) клетке. Суть этого метода основана на обнару­жении маркированных искусственным изотопом молекул с по­мощью фотоэмульсии, которой покрываются срезы клеток и тканей, фиксированных в разные сроки после введения меченого предшественника.

Иммуноцитохимический метод

В настоящее время возможен и очень точный качественный анализ индивидуальных белков клеточных структур в пределах целостной клеточной системы. Такой анализ производится с по­мощью иммуноцитохимических методов. Суть этих методов за­ключается в том, что конкретный белок служит антигеном, к которому в организме каких-либо млекопитающих вырабатываются специфические антитела. Последние соединяются с флюоресци­рующим красителем или другим маркером. Затем сывороткой с маркированными антителами обрабатывается изучаемая клет­ка. Специфические маркированные антитела связываются при этом строго избирательно со структурами, содержащими иссле­дуемые белки. С помощью этого метода, в частности, была вы­явлена локализация основных и вспомогательных сократимых белков актин-миозиновой системы в субмембранном фибрилляр­ном аппарате клеток, показана модификация их распределения при формировании митотического аппарата и в процессе цито­томии. Этот же метод был с успехом применен для доказатель­ства справедливости жидкостно-мозаичной модели организации мембран.

Комплексные методы исследования клетки

В последнее время особенно большие успехи в изучении структурно-биохимической организации клеток достигнуты при комплексном использовании методов ультраструктурного ана­лиза и методов цитохимии и авторадиографии. Эти успехи обус­ловлены в основном разработкой специальных методов цито­химии и авторадиографии на ультраструктурном уровне, позво­ляющих непосредственно проанализировать процессы метабо­лизма на названном уровне организации клеток, «структуриро­вать» биохимические процессы, выяснить конкретное значение тех или иных клеточных структур в отдельных звеньях сложных процессов внутриклеточного метаболизма. В таком плане на­коплен обширный материал о роли различных разновидностей мембранной фазы цитоплазмы в синтетических анаболических процессах и процессах внутриклеточного катаболизма.

Крупные успехи достигнуты, в частности, в изучении орга­низации и функционирования лизосомного аппарата клеток. Важные новые факты получены при исследовании ядерного аппа­рата клеток. С помощью цитохимических методов удается иден­тифицировать рибонуклеопротеиды (РНП) и дезоксирибонуклеопротеиды (ДНП) на ультраструктурном уровне и тем самым значительно продвинуться вперед в изучении организации тран­скрипции, созревания и внутриядерного транспорта различных типов РНП в клетках эукариот, а использование метода элек­тронной авторадиографии позволило детализировать роль отдельных клеточных структур в этих процессах. Например, удалось подробно изучить функцию ядрышка и конкретно струк­турировать в нем процессы образования рибосомальной РНК.

Такой синтез молекулярно-биологических и структурно-био­химических аспектов и методов весьма характерен и для разра­ботки многих других важных вопросов о тонкой организации отдельных компонентов клеток. При этом тесная связь молеку­лярно-биологического и морфобиохимического цитологического анализа проявляется не только в синтезе конечных результатов, но и в их взаимодействии в процессе самого исследования. Подобное взаимодействие осуществляется либо путем проведе­ния комплексных работ с использованием как биохимических, так и цитологических методов специалистами биохимиками и цитологами, либо путем применения специальных комплексных методов, находящихся на границе биохимического и цитологи­ческого анализа клеточных структур.

Примером первого рода является сочетание методов биохи­мического выделения компонентов клетки с их тонким ультраструктурным анализом. Таким путем впервые получены фото­графии работающих генов с идентификацией на них ДНК, РНКполимераз и транскрибируемых молекул РНК. Усовершен­ствование этого метода позволяет сейчас в некоторых случаях проводить учет интенсивности транскрипции путем прямого под­счета количества РНКполимеразных комплексов. С помощью электронного микроскопа можно непосредственно изучать кар­тины репликации ДНК на выделенных биохимическим методом, кольцевых или линейных молекулах ДНК. Методы ультраструктурного анализа широко используются также при иммуноцитохимическом исследовании локализации индивидуальных белков, в субчастицах рибосом, при изучении различных уровней орга­низации ДНП и во многих других случаях.

Типичным примером специально разработанных комплекс­ных методов является гибридизация ДНК и РНК на срезах. Суть его заключается в следующем. ДНК, находящаяся в со­ставе ДНП целостной клетки, подвергается денатурации, а за­тем обрабатывается фракциями РНК, меченой радиоактивными, изотопами. В результате этого на ДНК авторадиографически выявляются участки, комплементарные данным фракциям РНК,, т. е. места транскрипции последних, иначе говоря, создается возможность точно установить локализацию определенных генов.

В рамках экспериментального метода функциональная организация клетки в целом или ее отдельных компонентов изучается путем изменения ее состоя­ния с помощью внешнего воздействия. Наблюдая затем измене­ния жизнедеятельности клетки или ее компонентов, можно сде­лать выводы о тех или иных свойствах исследуемых механизмов. Подобного рода метод получил сейчас в некоторых разделах цитологии весьма широкое распространение, а в отдельных ее областях цитофизиологический аспект анализа клеточных структур занимает пока доминирующее положение.

Именно таково состояние проблемы о транспортной функции поверхностного аппарата клетки. С одной стороны, в изучении этого вопроса достигнуты значительные успехи: на основании результатов цитофизиологического анализа удалось выявить разновидности трансмембранного транспорта веществ, охаракте­ризовать различные свойства транспортных систем. С другой стороны, окончательное решение вопроса о механизмах транс­мембранного транспорта возможно лишь при условии выясне­ния конкретной организации липидно-белковой системы мем­бран и точного знания свойств и роли остальных компонентов мембранных транспортных систем, т. е. на уровне структурно­биохимического анализа плазматической мембраны и всего по­верхностного аппарата клетки.

Ограниченность возможностей цитофизиологического иссле­дования трансмембранного транспорта отчетливо проявляется на примере состояния вопроса об организации ионных каналов, играющих основную роль во многих важных процессах, таких, например, как распространение нервного импульса. С помощью целого арсенала разнообразных цитофизиологических методов было показано, что в плазматической мембране существуют осо­бые каналы для ионов Na, К, Сl, различающиеся по своим свой­ствам. Однако конкретные знания их структурной организации ограничиваются пока косвенными данными об их белковой при­роде. Таким образом, решение вопроса об организации ионных каналов в частности и транспортных систем мембраны вообще переходит, по-видимому, в руки ученых, владеющих структурно-биохимическими методами, ибо в данном случае многочислен­ные и весьма ценные факты, добытые в цитофизиологических исследованиях, представляют собой лишь первый феноменоло­гический этап в анализе этих общеклеточных механизмов. Тем не менее в определенных аспектах изучения клетки цитофизиологический подход может дать очень много.

В настоящее время разнообразие приемов цитофизиологиче­ских исследований определяется как все возрастающим арсена­лом агентов, появляющихся у цитологов, так и использованием тонких методов анализа тех изменений, которые происходят в результате действия этих агентов на клетку. Если раньше для анализа изменений клеток под действием внешних агентов при­менялись такие привычные для физиологов методы, как реги­страция электрических потенциалов, оценка клеточного дыхания по поглощению кислорода, количественная оценка сорбции кра­сителей, регистрация качественных изменений окрашиваемости клеток и т. д., то сейчас в подобных целях все чаще исполь­зуются методы, характерные для структурно-функционального направления: электронно-микроскопическое изучение ультраструктурных изменений, авторадиографический анализ синте­тических процессов и т. д.

Среди агентов, применяемых в экспериментальных исследо­ваниях, можно выделить две основные группы. Первую группу составляют вещества, «точка приложения» которых внутри клетки более или менее известна, — это вещества, блокирующие отдельные звенья внутриклеточного метаболизма (например, актиномицин D, ингибирующий транскрипцию, или пуромицин, блокирующий синтез белка, 2,4-динитрофенол, разобщающий дыхание и окислительное фосфорилирование), вещества, изби­рательно разрушающие те или иные клеточные структуры (на­пример, колхицин, разрушающий микротрубочки, или цитохалазин В, действующий на микрофибриллы). Вторую группу со­ставляют агенты так называемого комплексного действия, из­меняющие клеточный метаболизм вообще, — температура, осмо­тическое давление, pH и т. д. Использование таких агентов, как, например, 2,4-динитрофенол, позволило выяснить ряд вопросов, касающихся сопряжения дыхания и фосфорилирования в ды­хательной цепи митохондрий; применение ингибиторов синтеза РНК и белка дало возможность изучить некоторые звенья син­теза белка в рибосомах и процессов транскрипции; с помощью колхицина и цитохалазина выяснена роль микротрубочек и микрофиламентов в процессах внутриклеточного транспорта.

Агенты второй группы (комплексного действия) обладают тем преимуществом, что они являются для клеток как бы более естественными, ибо клетки в природных условиях сталкиваются с подобными изменениями во внешней среде. В то же время они влияют практически на все стороны клеточного метабо­лизма, затрудняя анализ происходящих при этом изменений. Тем не менее исследование действия на клетку подобных аген­тов имеет самостоятельное значение и абсолютно необходимо для изучения механизмов адаптации клеток к меняющимся фак­торам внешней среды, решения вопроса о соотношении специ­фических и неспецифических процессов в реакции клеток на внешнее воздействие и других аналогичных задач, играющих важную роль в разработке проблемы клеточной интеграции.

В исследовании функциональной организации клеток огром­ное значение имеет анализ механизмов взаимодействия отдель­ных систем клетки. Во многих случаях такую задачу можно разрешить путем создания специальных экспериментальных моделей. Наиболее типичными примерами подобного рода яв­ляются пересадки ядер у разных объектов (простейшие, яйце­клетки амфибий); гибридизация соматических клеток; пере­садки частей клеток у простейших; исследования с применением целого ряда других микрохирургических приемов, проводимые на протозоологических объектах и культивируемых in vitro клетках млекопитающих.

С помощью подобных моделей были изучены важнейшие общецитологические вопросы. Например, результаты опытов по пересадке ядер дифференцированных клеток амфибий в лишен­ную собственного ядра яйцеклетку явились одним из наиболее убедительных аргументов в пользу теории дифференциальной активности генов. Суть последней заключается в констатации структурной идентичности геномов дифференцированных клеток многоклеточного организма. Из этого следует принципиально важное положение о том, что процесс дифференцировки про­исходит не путем необратимых изменений наследственного аппа­рата клеток, а путем регуляции активности одинакового для всех клеток данного организма набора генов.

Весьма интересные факты были обнаружены на эксперимен­тальной модели для изучения процесса дедифференцировки гибридной клетки — куриного эритроцита и раковой клетки мле­копитающих. Своеобразие этого гетерокариона заключается в том, что при слиянии куриного эритроцита с раковой клеткой происходит гемолиз гемоглобина и нормальное, почти полностью инактивированное ядро эритроцита оказывается в цитоплазме раковой клетки. Таким образом, здесь осуществляется пере­садка дифференцированного ядра в необычные условия актив­ной цитоплазмы. Тщательные наблюдения за изменением струк­турной организации этих ядер показали, что в новых условиях происходит значительное увеличение их объема. Существенную роль в набухании ядер играют поступающие из цитоплазмы белки. Эти внешние изменения в ядерном аппарате эритроцита отражают глубокие процессы перестройки его внутренней орга­низации, результатом чего является возобновление транскрип­ции «куриных» информационных РНК. Однако реализация со­держащейся в ней информации в виде синтеза «куриных» бел­ков не происходит до тех пор, пока в ядерном аппарате куриных эритроцитов не сформируется ядрышко и не начнется синтез рибосомальных РНК. Таким образом, тщательный анализ экспе­риментальных моделей показал наличие сложного цитоплазма­тического контроля над деятельностью ядерного аппарата.

С помощью экспериментальных моделей удалось решить и ряд других важных общецитологических вопросов. Например, вопрос о механизмах перемещения анафазных хромосом был с успехом исследован на нативном митотическом аппарате, вы­деленном из дробящихся бластомеров морского ежа и рабо­тающем вне клетки. Преимущественно на экспериментальных моделях удалось установить широко распространенную общую закономерность организации клеток, а именно отсутствие во взаимосвязи сложных внутриклеточных процессов жесткого причинно-следственного принципа. Оказалось, что такие много­компонентные процессы, как репродукция клеток, процессы син­теза и внутриклеточного транспорта высокополимерных соеди­нений и т. д., состоят из отдельных, относительно автономных этапов, не связанных жесткой причинно-следственной зависи­мостью. Выяснение этой закономерности, с одной стороны, соз­дает предпосылки для понимания механизмов удивительной пластичности клеточной организации. С другой стороны, эта же закономерность является основой для изучения механизмов интеграции таких процессов в целостной клеточной системе в нормальных условиях.

В настоящее время все увеличивается количество и разно­образие экспериментальных моделей, предназначенных для решения тех или иных конкретных общецитологических проблем. Это значительно способствует прогрессу наших знаний в отно­сительно слабо изученной области цитологии — механизмах взаимодействия и интеграции работы субклеточных систем.

Необходимо подчеркнуть, что спецификой исследований, про­водящихся в рамках экспериментального подхода к анализу закономерностей организации клетки, является все большее и большее углубление критериев и признаков, по которым ведется анализ интегрирующих механизмов и конкретных функций от­дельных клеточных структур При этом становится ясным, что успешное решение стоящих перед такими исследованиями за­дач возможно лишь при широком внедрении в практику мето­дов структурно-функционального подхода.

Суть сравнительно-цитологического метода исследова­ний в общей цитологии — выяснение общих закономерностей организации клеток с использованием всего многообразия их разновидностей, предоставляемого ученому живой природой. Сравнительный метод имеет два аспекта. С одной стороны, он по традиции применяется для выявления родственных взаимо­отношений между отдельными разновидностями клеток (особен­но для одноклеточных организмов). На основе созданной таким путем и проведенной с использованием тонких цитологических критериев филогенетической систематики прокариотных и низ­ших и высших эукариотных клеток возникает возможность про­следить становление и отдельных частных клеточных систем, и общих механизмов регуляции и интеграции клетки как це­лостной системы В качестве примера подобного рода примене­ния сравнительно-цитологического анализа в исследованиях клеток можно привести интересные данные по тонкой организа­ции ядерного аппарата у прокариотных, низших и высших эука­риотных клеток

Принципиальными особенностями организации ядерного аппарата эукариотных клеток являются наличие у них слож­ного поверхностного аппарата ядра, значительно большее по сравнению с прокариотными клетками количество ДНК, сосре­доточенной в хромосомах, и, наконец, своеобразная упаковка ДНК с помощью основных белков — гистонов Сравнительно­цитологический анализ ядерных аппаратов низших эукариот позволил выявить среди них клетки, которые по строению ядра занимают промежуточное положение между про- и эукариотными клетками. Панцирные жгутиконосцы обладают типичным поверхностным аппаратом ядра, но при этом их хромосомы, как и в случае прокариот, образованы кольцевидными молеку­лами ДНК, которые организованы в компактные структуры без участия гистонов, характерных для всех эукариот

В последнее время в связи с открытием принципиальных осо­бенностей в организации генома про- и эукариотных клеток сопоставление процессов транскрипции и созревания РНК у этих организмов, а также у мезокариот и клеток низших эукариот приобретает важное значение В результате таких сопоставле­ний, возможно, будут внесены существенные изменения в наши традиционные представления о родственных взаимоотношениях в основных группах организмов и, в частности, взаимоотноше­ниях про- и эукариотных клеток.

Вторым примером традиционного применения эволюционного подхода к цитологическим проблемам могут быть попытки пред­ложить гипотезу усложнения механизмов равнонаследственного распределения хромосом между дочерними клетками в процессе эволюции, разработанную на основании сравнительного анализа многочисленных вариантов расхождения хромосом у простейших и у низших растений. В этих случаях активное участие в про­цессах расхождения хромосом принимают мембраны ядерной оболочки, что позволяет проводить известную гомологию с клет­ками прокариот, у которых мембране клетки принадлежит ве­дущая роль в равномерном распределении сестринских хромо­сом между дочерними клетками.

Наконец, третьим примером традиционного эволюционного подхода к общецитологическим проблемам может служить ши­роко распространенная симбиотическая гипотеза происхождения митохондрий и хлоропластов. Суть ее заключается в предполо­жении о том, что эти важные органоиды энергетического обмена возникли из внедрившихся в эукариотные клетки прокариотных организмов на относительно раннем этапе эволюции эукариот.

Несмотря на важное значение подобного рода общебиологи­ческих построений для развития общей цитологии, традиционный исторический подход к разработке общецитологических проблем имеет сейчас все же довольно ограниченное применение. Одной из основных причин такого положения является наличие специ­фических и все еще недостаточно изученных особенностей эво­люционного процесса на клеточном и субклеточном уровнях организации, что крайне затрудняет определение родственных отношений между отдельными группами одноклеточных орга­низмов, а следовательно, и построение обоснованных эволюцион­ных гипотез в области общей цитологии.

В настоящее время более широко распространен другой аспект использования сравнительно-цитологического метода, не преследующий цели прямого выяснения исторической обуслов­ленности той или иной клеточной структуры или процесса. В современной общей цитологии такой аспект применения срав­нительного метода претерпел несколько видоизменений.

На первом этапе, в период внедрения в практику цитологи­ческого анализа принципиально новых морфобиохимических методов, выбор объекта исследования определялся следующими соображениями. Во-первых, имело значение удобство того или иного объекта для применения используемого метода. Во-вто­рых, большую роль играла степень выраженности данного при­знака у исследуемой клетки. Так, для изучения общих законо­мерностей организации клеток эукариот излюбленным объектом были клетки печени млекопитающих с их гармонично развитой системой мембранных органоидов Классические работы по ана­лизу процессов внутриклеточного транспорта и созревания сек­рета были выполнены на клетках поджелудочной железы и сли­зистых бокаловидных клетках млекопитающих.

Для комплексных цитологических и молекулярно-биологиче­ских исследований организации клеток прокариот широко использовалась кишечная палочка; моделями для изучения организации низших эукариот являлись дрожжи и плесневой гриб. При этом оказалось, что установленные на данных объектах закономерности имеют универсальное значение, по­скольку они во многих случаях принципиально сходны у всех эукариотных или у всех прокариотных клеток. Более того, ряд закономерностей субклеточной организации, особенно на моле­кулярном и надмолекулярном уровнях, оказался универсаль­ным для клеток и про-, и эукариотного типа (организация мем­бран, принцип строения рибосом и т. д.), несмотря на то, что названные типы клеток по некоторым признакам принципиально различаются между собой. Это обстоятельство породило пред­ставления о том, что можно разрабатывать основные общецито­логические проблемы на ограниченном круге объектов, удобных в методическом отношении, а затем распространять установ­ленные закономерности на другие клетки в силу их принци­пиально сходной организации.

Однако в последние годы такое упрощенное использование сравнительного подхода начало подвергаться критике по мере внедрения современных цитологических методов в специальные биологические науки о клетке — частную цитологию, протозоо­логию, ботанику низших растений. Морфобиохимический анализ, примененный в этих областях науки, позволил установить факты, свидетельствующие об огромном разнообразии конкрет­ной реализации того или иного общего признака организации клетки, разнообразии значительно большем, чем следовало из результатов, полученных ранее на «модельных» объектах. Осо­бенно велико это многообразие на высших субсистемных и си­стемных уровнях организации клетки. Характерно оно и для столь сложных и многокомпонентных процессов, как процессы внутриклеточного метаболизма и транспорта или равнонаслед­ственного распределения генетического материала при делении клеток.

Обобщение большого сравнительно-цитологического мате­риала, полученного на уровне современных методических воз­можностей, заставило отказаться от упомянутого выше упро­щенного представления о роли сравнительного метода. В связи с этим в общей цитологии (особенно в отношении эукариотных клеток) доминирующее положение приобретают представления о необходимости использовать сравнительный метод для ана­лиза отдельных аналогичных по функциональной деятельности клеточных систем или процессов во всем многообразии их проявлений у конкретных клеток При таком подходе особый инте­рес вызывают не «типичные», «средние» клетки, а, напротив, клетки, резко уклоняющиеся от среднего типа организации, клетки, в которых гипертрофированы те или иные признаки.

Наибольшее число таких «уклоняющихся» вариантов встре­чается среди клеток высших многоклеточных организмов, где развита далеко заходящая специализация клеток в составе от­дельных тканевых систем. Случаи «уклонения» от среднего типа широко распространены также среди высших простейших, ко­торые подвергались эволюции, сохраняя при этом одноклеточ­ный уровень организации. Именно при исследовании такого рода нетипичных клеток удалось выявить большое количество новых интересных фактов, значительно углубляющих наши пред­ставления и об общих закономерностях клеточной организации, и об ее эволюционной пластичности, которая и обусловливает наблюдаемое многообразие клеточных систем. При этом, как уже отмечалось выше, в случае частных наук наибольший инте­рес вызывает именно специфика проявления у различных объ­ектов общих признаков, характерных для всех клеток.

В отличие от специальных наук при общецитологическом подходе вопрос этот ставится несколько в другой плоскости, ибо исследователь стремится выяснить, насколько широко распро­странена у разных клеток специфика проявлений данного при­знака, какой комбинацией общих механизмов и каких именно она обусловлена. Так, например, протозоологам удалось обна­ружить весьма интересную динамику формирования макронук­леуса после конъюгации у брюхоресничных инфузорий. В фор­мирующемся макронуклеусе происходит значительное увеличе­ние количества ДНК, а затем наблюдается резкая редукция наследственного материала (вплоть до 93%). Такой процесс редукции генетического материала имеет место и в соматиче­ских клетках ряда групп многоклеточных животных (некоторые насекомые, нематоды). Оставшаяся ДНК, небольшая по общему количеству, но содержащая всю необходимую для функциони­рования макронуклеуса информацию, многократно реплици­руется. В результате создается дефинитивный макронуклеус, который отличается от микронуклеуса не только по количеству ДНК, но и по ее качественному составу. Здесь отсутствует по­давляющая часть нефункционирующих генов, в то время как функционирующие локусы представлены значительным количе­ством копий.

Эти факты представляют большой общецитологический ин­терес именно потому, что, как правило, наблюдаемые здесь явления выступают не просто в качестве парадоксальных, свой­ственных лишь высшим одноклеточным организмам признаков. Так, процессы политенизации, избирательной репликации отдельных участков ДНК хромосом и, наконец, избирательная редукция значительных участков генома — все эти явления имеют место и у специализированных клеток многоклеточных организмов. Они и осуществляются, вероятно, на базе общих элементарных механизмов. А специфика сложного процесса изменений ядерного аппарата при формировании макронуклеуса у брюхоресничных инфузорий обусловлена в основном свое­образной комбинацией общих, универсальных для эукариотных клеток элементарных механизмов. Такого рода представления получают сейчас в общей цитологии широкое распространение. Они чрезвычайно стимулируют направленные сравнительно- цитологические исследования, посвященные выяснению важных общецитологических проблем. Материал с сайта http://wiki-med.com

Примером целенаправленного сравнительно-цитологического исследования может служить изучение вопроса о механизмах равнонаследственного распределения хромосом во время митоза у эукариот путем анализа митоза разных видов диатомовых водорослей: на этих объектах в отличие от типичных митозов метазойных клеток удается четко морфологически проследить сложные изменения микротрубочкоорганизующих центров, фор­мирование и взаимное расхождение микротрубочковых полуверетен, расхождение хромосом к полюсам клетки с помощью формирования в метафазе своеобразной структуры — ворот­ничка.

В свете последних данных о ведущей роли тубулин-динеиновой механохимической системы в анафазном перемещении хромосом у метазойных клеток весьма вероятно предположить, что эта система присутствует и у диатомовых водорослей, т. е. и здесь имеет место лишь своеобразная комбинация элементар­ных механизмов, общих для всех клеток и обусловливающих механохимические процессы при митозе.

Очевидно, что для анализа этих механизмов, выяснение ко­торых представляет одну из весьма актуальных проблем общей цитологии, перспективным было бы наличие такого объекта, где они четко дифференцированы и морфологически выражены.

Количество подобного рода примеров непрерывно растет. Это обусловлено, с одной стороны, все расширяющимся внедре­нием комплексных современных методов в практику частноци­тологических, протозоологических и ботанических исследований, с другой стороны, накоплением в самих сравнительно-цитологи­ческих исследованиях фактов, которые приобретают все боль­шее значение для общей цитологии и оказываются в центре ее внимания. А все это, в свою очередь, приводит к тому, что срав­нительно-цитологический анализ начинает занимать в цитоло­гии исключительно важное место.

Краткая характеристика основных направлений и аспектов современных общецитологических исследований показывает, что на данном этапе развития цитологии существует как достаточно четкое разграничение отдельных направлений, так и их синтез. Разграничение имеет место и в методическом отношении, и в отношении логики решения конкретных задач, поставленных в пределах каждого из направлений и подходов. В морфофунк­циональном аспекте цитологических исследований доминирует дискретный подход к анализу клеточных структур. Одной из наиболее важных особенностей экспериментального подхода к изучению закономерностей клеточной организации является его ориентация на анализ общих интегрирующих механизмов организации клеточных систем и целостной клетки. При этом, как уже подчеркивалось выше, решение стоящих перед такими исследованиями задач невозможно без широкого использования методов, присущих морфофункциональному подходу. Экспери­ментальный анализ дает феноменологическую характеристику свойств тех или иных клеточных механизмов и внутриклеточ­ных процессов, создавая тем самым необходимую базу для при­менения богатого арсенала структурно-биохимических методов.

Таким образом, на современном этапе развития общей цито­логии имеются предпосылки для весьма тесного объединения этих двух аспектов цитологических исследований. Это и есте­ственно, так как в конечном итоге оба подхода преследуют одну цель — выяснение функциональной организации клеточ­ных структур и механизмов регуляции процессов в целостной клеточной системе.

Сравнительно-цитологический подход к анализу общецитоло­гических проблем занимает в современной общей цитологии особое положение. Сравнительно-цитологический анализ про­водится на основе данных, получаемых на базе морфофункцио­нального и экспериментального подходов, т. е. в методическом отношении все главные аспекты цитологических исследований оказываются тесно связанными друг с другом.

Спецификой сравнительно-цитологического подхода, специ­фикой, обусловливающей его особое положение, является целе­направленное использование разнообразных объектов живой природы для исследования общих закономерностей организации отдельных клеточных структур, внутриклеточных процессов и интегрирующих механизмов во всем многообразии их проявле­ний у различных типов клеток.

Итак, как видно из вышеизложенного, основные направления цитологических исследований в значительной мере определяют специфику современного этапа развития общей цитологии и обусловливают ее тесную взаимосвязь со смежными биологи­ческими науками. Одной из наиболее характерных особенностей этого этапа является тесная взаимосвязь всех важнейших на­правлений цитологических исследований в методическом отно­шении. Больше того, такое методическое комплексирование часто выходит уже за рамки общей цитологии.

В цитологических работах широко используются чисто био­химические и молекулярно-биологические методы, и наоборот, в биохимических и молекулярно-биологических исследованиях широко применяются цитологические морфологические методы. Методическое комплексирование смежных наук и единство их конечных целей обусловили формирование новой синтетической науки о клетке — биологии клетки. Она объединяет цитологию, структурную биохимию, молекулярную биологию, молекулярную генетику и частные биологические науки о клеточном уровне организации. Такое объединение смежных наук, несомненно, прогрессивное явление. Однако, несмотря на подобный синтез, каждая из наук сохраняет и свою методическую специфику, и специфику в постановке и способах разработки проблем орга­низации клеток. В настоящее время доминирующее положение в этой синтетической науке принадлежит исследованиям моле­кулярно-биологического и молекулярно-генетического направле­ний. Такое положение обусловлено бурным прогрессом наших знаний о низших уровнях организации клеток, но оно пред­ставляет собой лишь временное явление.

По сути дела ведущее место в новой синтетической науке о клетке должна занять общая цитология — наука об общих за­кономерностях клеточного уровня организации живой материи. Из современных биологических наук, занимающихся этим уров­нем организации живой материи, общая цитология, расширяя целенаправленный сравнительно-цитологический подход, бази­рующийся на структурно-биохимических методах, наиболее под­готовлена к глубокому общебиологическому обобщению огром­ного фактического материала по дискретному анализу отдель­ных клеточных структур в многочисленных разновидностях кле­ток. Ведущее положение должна занять общая цитология и в анализе общеклеточных интегрирующих механизмов. Важной предпосылкой к этому является бурная разработка новых экспе­риментальных моделей. Их углубленный анализ современными методами и широкое внедрение экспериментальных моделей в целенаправленные сравнительно-цитологические исследования должны обеспечить прогресс в решении одной из основных про­блем организации клеток — проблемы клеточной интеграции.

По мере накопления фактического материала об элементар­ных универсальных механизмах интеграции клетки и размахе их модификаций именно перед общей цитологией стоит задача провести глубокий анализ исторической обусловленности орга­низации частных клеточных систем и клеточной организации в целом, а также специфики эволюционного процесса на клеточ­ном и субклеточном уровнях организации живой материи. Реше­нию этой задачи способствует отчетливо проступающая сейчас в общецитологических исследованиях тенденция к сочетанию дискретного анализа отдельных компонентов клетки с изуче­нием ее кг. к целостной системы.