Синтез антител
Поскольку эпитопов микробов чрезвычайно много, генов, содержащихся в геноме человека и кодирующих структуру антигенсвязывающих сайтов, катастрофически не хватает. Выход из этой ситуации один — продуцировать новые нуклеотидные последовательности на основании сравнительно небольшою количества генов антигенного распознавания за счет многочисленных случайных перестроек — рекомбинаций генетического материала (реаранжировка генов). Собственно процессы рекомбинации включают в себя вырезание, перенесение, стыковку и модификацию полинуклеотидных последовательностей, что создает большое количество разнообразных антигенраспознающих рецепторов.
Синтез константного участка антител
За синтез константного участка отвечает так называемый С-ген, который также представлен несколькими сегментами, однако они находятся в ДНК вместе. Именно продукты С-гена определяют классовую принадлежность антител. Известно 5 основных классов иммуноглобулинов — IgM, IgG (подклассы G1, G2, G3, G4), IgA (подклассы А1, А2), IgE и IgD. Их С-сегменты обозначаются соответствующими греческими буквами. Эти сегменты располагаются в геноме в следующем порядке — Cμ, Сδ, Сγ3, Сγ1, Сα1, Сγ2, Сγ4, Сε, Сα2. Такая последовательность и определяет порядок синтеза одним В-лимфоцитом иммуноглобулинов разных классов.
Синтез вариабельного участка антител
V-ген
Ген, который кодирует структуру вариабельного участка, получил название V-гена (англ. variable — разнообразный). Он состоит из трех сегментов — V-сегмента (собственно вариабельною), D-сегмента (дополнительного разнообразия) и J-сегмента (соединительного, англ. — joining). Особенность V-гена состоит в том, что изначально он не существует в геноме как целостная структура. В разных участках ДНК содержатся его составляющие сегменты (V, D и J), представленные многими вариантами. Так, установлено, что V-группа содержит около 1000 сегментов, D-группа — 10, a J — 4 сегмента. Тем не менее для построения антигенсвязывающего сайта рецептора достаточно комбинации всего трех сегментов — по одному из каждой из указанных групп. Богатый набор различных вариантов одного и того же сегмента обеспечивает чрезвычайно широкие возможности для генетических рекомбинаций, в результате которых и создается V-ген.
Рецептор антигенного распознавания В-лимфоцита состоит из двух цепей — тяжелой и легкой, которые отличаются длиной, а значит — и молекулярной массой. В построении антигенсвязывающих участков принимают участие обе цепи, а конечную (хвостовую) часть константного участка формирует одна тяжелая цепь. Поэтому для синтеза рецептора необходимо создать по крайней мере два V-гена — для синтеза вариабельного участка тяжелой и легкой цепи. Как уже отмечалось ранее, изначально V-ген не существует как целостная структура, а представлен разрозненными фрагментами — V-, D- и J-сегментами, в которых содержится информация о строении вариабельных участков рецепторов.
Принцип формирования V-гена состоит в случайном выборе по одному сегменту из каждой группы (V, D, J) и их пространственном сближении. При этом все участки ДНК, расположенные между выбранными сегментами, вырезаются. Сначала выбираются D- и J-сегменты, а потом к образованному комплексу DJ присоединяется один из сегментов V-группы. Образованная последовательность V-D-J и является V-геном. Возникает вопрос: на каком основании происходит выбор сегментов из указанных групп для формирования V-гена? Ответ — случайно. Случайность выбора обеспечивается активацией специальных ферментов — рекомбиназ, способных наугад выбирать по одному сегменту из каждой группы и присоединять их друг к другу. Установлено, что подобные ферменты синтезируются по крайней мере на двух генах (RAG1 и RAG2), которые называются рекомбинант-активирующими. По функциям, которые выполняют ферменты, задействованные в создании V-гена, их можно разделить на нуклеазы (экзо- и эндо-), разрезающие цепи изнутри (эндонуклеазы) или с конца (экзонуклеазы), транcферазы, которые осуществляют перенос сегментов или отдельных нуклеотидов, и лигазы, сшивающие компоненты новообразованных комбинаций, восстанавливая непрерывность нитей ДНК.
Как работают рекомбиназы? Сначала происходит пространственное сближение случайно выбранных сегментов, в связи с чем участок ДНК, расположенный между ними, собирается в складку, названную «петлей». После этого образованная петля приобретает стабильную конфигурацию, удерживая выбранные сегменты рядом друг с другом. Дело в том, что участки ДНК между группами сегментов V-гена содержат симметрично расположенные комплементарные друг другу зоны. В связи с симметричностью расположения при образовании петли такие зоны оказываются друг против друга, а благодаря комплементарности нуклеотидного состава — соединяются между собой по принципу замок-молния. Как только петля приобрела стабильную конфигурацию, нуклеазы отрезают ее с обеих сторон, а лигазы объединяют выбранные сегменты V-гена, восстанавливая непрерывность цепи ДНК.
Поскольку количество V-сегментов является наибольшим, то случайный выбор именно сегмента этой группы главным образом и определяет разнообразие рецепторного репертуара. Кроме этого, V-сегменты являются наиболее длинными и кодируют около 95 аминокислотных остатков, в то время как комплекс DJ — не более 14. Поэтому большая часть вариабельного участка построена именно из продукта V-сегмента.
D-сегменты (от англ. — diversity) являются факторами дополнительного разнообразия. Реальное количество таких сегментов значительно увеличивается. Дело в том, что участок ДНК, где помещаются D-сегменты, может претерпевать транскрипцию в трех рамках считывания, одна из которых избирается случайно. При этом в условиях каждой рамки считывания полностью меняется содержание всех сегментов D-группы, то есть «возникают» новые сегменты. Это обусловлено триплетностью генетического кода. При смещении начала транскрипции лишь на один нуклеотид заново происходит условное перераспределение нити ДНК на тройки нуклеотидов, что изменяет состав всех триплетов, а значит, обуславливает дальнейший синтез полипептидной цепи принципиально нового аминокислотного состава.
J-группа мало влияет па формирование разнообразия рецепторного аппарата, поскольку содержит ограниченное количество сегментов.
Тем не менее именно эти сегменты соединяют вариабельный участок антитела с константным (отсюда к название).
За счет случайных комбинаций сегментов образуется огромное количество разнообразных V-генов. Если учесть, что в формировании целостного рецептора принимает участие еще и легкая цепь, также образованная согласно описанным принципам, то количество разнообразных антигенсвязывающих сайтов увеличивается до 1011. Тем не менее даже такое количество разнообразных комбинаций является недостаточным для эффективного распознавания эпитопов всех возможных патогенов. Для расширения разнообразия привлекаются дополнительные случайные механизмы, которые изменяют структуру места соединения V- и D- сегментов (рис 22). Вследствие удаления участка ДНК, который находится между случайно выбранными V- и D-сегментами, нуклеиновая кислота разрывается на две нити-фрагмента. На концах обращенных друг к другу фрагментов и помешаются соответственно V- и D-сегмент. Высвобожденные концы очень ранимы, поскольку являются оголенными частями молекулы, а поэтому — потенциально чувствительны к деструктивным влияниям, что ставит под угрозу существование ДНК. Для стабилизации молекулы ферменты репарации наугад достраивают короткие нуклеотидные последовательности к оголенным концам — по две с внутренних концов нитей-фрагментов, поскольку ДНК, как известно, является двухцепочечной молекулой. Потом достроенные последовательности замыкаются «сами на себя» за счет формирования 3/-5/-сложноэфирной связи между терминалями целей ДНК. При этом оголенные концы исчезают. Образованная конечная структура получила образное название шпильки. Однако шпильки препятствуют восстановлению непрерывности ДНК, то есть соединению нитей-фрагментов между собой. Поэтому эндонуклеазы разрывают нуклеотидную последовательность в основе одной из ножек шпильки. За счет этого снова высвобождается оголенный конец одного из полинуклеотидных цепей нити-фрагмента, а конец второго оказывается прикрытым полинуклеотидной достройкой двойной длины. На терминале второй нити происходят подобные изменения. Затем происходит репликация достроек на обеих нитях-фрагментах и соединение последних. Поэтому между V- и D-сегментами при соединении оказываются два участка случайных последовательностей (Р-фрагменты), которые определенным образом изменяют структуру будущего V-гена. Более того, во время объединения нитей-фрагментов специальный фермент дезоксирибонуклеотидилтрансфераза успевает наугад встроить в место соединения еще несколько нуклеотидов, что приводит к дальнейшим изменениям в V-гене. Именно таким образом между P-фрагментами формируется N-фрагмент случайного состава — результат деятельности указанной транcферазы. Поэтому при формировании вариабельных участков рецепторов параллельно с комбинационными происходят и определенные мутационные изменения (случайные последовательности и встроенные нуклеотиды), за счет которых новообразованный V-ген не является простой суммой V-, D- и J-сегментов (рис. 22). Материал с сайта http://wiki-med.com
После того как V-ген сформирован, процессы рекомбинации ДНК приостанавливаются, и начинается транскрипция новообразованной последовательности нуклеотидов, которая включает собственно V-ген, незадействованные сегменты V- и J-групп, сохранившиеся при сращении цепей, а также — все С-сегменты. При этом получается первичная РНК. В дальнейшем первичная РНК претерпевает сплайсинг («созревание») — все ее С-сегменты и незадействованные V- и J-сегменты вырезаются, а остается лишь V-ген и Cμ. При этом первичная РНК превращается в РНК-предшественницу. В процессе трансляции на такой РНК-предшественнице будет сформирована тяжелая цепь будущею рецептора, который появится на поверхности лимфоцита вместе с суррогатной цепью. Последняя кодируется генами, которые не претерпевают перестройку. Экспрессия такого антигенраспознающего рецептора необходима иммунокомпетентной клетке для взаимодействия с микроокружением и дальнейшего выживания. Дело в том, что взаимодействие с эпителиальными клетками, составляющими микроокружение, препятствует спонтанному апоптозу лимфоцита. Это означает, что выживают только те иммунокомпетентные клетки, которые способны распознавать структуры собственного организма. На этом этапе выбраковываются лимфоциты, содержащие дефектные антигенсвязывающие участки тяжелых цепей. Поскольку процессы рекомбинации происходят наугад, клеток с такими рецепторами будет довольно много. В дальнейшем в процесс рекомбинации будут привлечены гены легких цепей антитела, которые и сменят суррогатные цепи на поверхности клетки. Следует отметить, что V-ген легкой цепи формирует лишь V- и J-сегменты. Таким образом, получается первичный антигенраспознающий рецептор В-лимфоцита — IgM-мономер (рис. 23).
По мере созревания В-лимфоцит начинает экспрессировать IgD-рецептор. Синтез других рецепторов происходит лишь во время реализации иммунного ответа, поскольку для этого необходимо соответствующее цитокиновое влияние и контакт с активированным Т-лимфоцитом. Переключение на синтез антител другого класса происходит за счет использования других С-сегментов, что приводит к изменению нуклеотидных последовательностей не в информационной РНК, как это было при созревании клетки, а на уровне ДНК. При этом снова активируются нуклеазы, выделяющие и приобщающие один из С-сегментов (соответственно цитокиновому профилю) к комплексу VDJ. Все другие С-сегменты, расположенные в цепи по правую сторону от избранного, вырезаются и навсегда утрачиваются В-лимфоцитом. Поэтому В-клетка не способна синтезировать, например, иммуноглобулин М после иммуноглобулина G, поскольку при синтезе последнего был утрачен сегмент Cμ, кодирующий константный участок IgM и находящийся по правую сторону от любого из Сγ сегментов. Но вполне естественным будет переход, в частности, с синтеза IgM на синтез IgG1 Таким образом, В-лимфоцит, который синтезирует IgA2, уже не может синтезировать ни одного другого антитела, поскольку безвозвратно утратил все С-сегменты, кроме Сα2. Теперь мы можем объяснить, почему во время созревания В-клетки присоединение С-сегмента происходит на уровне РНК и синтезируется именно IgM. Сохранение всех С-сегментов ДНК позволяет В-лимфоциту в дальнейшем продуцировать любой класс антител. При этом все антитела данной В-клетки независимо от их класса будут содержать одинаковые антигенсвязывающие сайты, поскольку все разнообразие V-, D- и J-сегментов утрачено еще в период созревания. Изменяется лишь экспрессия С-сегментов (рис. 24).
bpvtytybt dfhbf,tkmys[ exfcnrjd fynbntk
цепочка приводящая с синтезу антител
фермент отвечающи за синтез антител
почему антитела дают экспрессию
какое количество антител может синтезировать человек