Синтез антител

Поскольку эпитопов микробов чрезвычайно много, генов, со­держащихся в геноме человека и кодирующих структуру антигенсвязывающих сайтов, катастрофически не хватает. Выход из этой ситуации один — продуци­ровать новые нуклеотидные последовательности на основании сравнительно небольшою количества генов антигенного распознавания за счет многочислен­ных случайных перестроек — рекомбинаций генетического материала (реаранжи­ровка генов). Собственно процессы рекомбинации включают в себя вырезание, перенесение, стыковку и модификацию полинуклеотидных последовательнос­тей, что создает большое количество разнообразных антигенраспознающих ре­цепторов.

Синтез константного участка антител

За синтез константного участка отвечает так называемый С-ген, который также представлен несколькими сегментами, однако они находятся в ДНК вместе. Именно продукты С-гена определяют классовую принадлежность антител. Известно 5 основных классов иммуно­глобулинов — IgM, IgG (подклассы G₁, G₂, G₃, G₄), IgA (подклассы А₁, А₂), IgE и IgD. Их С-сегменты обозначаются соответствующими греческими бук­вами. Эти сегменты располагаются в геноме в следующем порядке — Cμ, Сδ, Сγ₃, Сγ₁, Сα₁, Сγ₂, Сγ₄, Сε, Сα₂. Такая последова­тельность и определяет порядок синтеза одним В-лимфоцитом иммуногло­булинов разных классов.

Синтез вариабельного участка антител

V-ген

Ген, который кодирует структуру вариабельного участка, получил назва­ние V-гена (англ. variable — разнообразный). Он состоит из трех сегментов — V-сегмента (собственно вариабельною), D-сегмента (дополнительного разно­образия) и J-сегмента (соединительного, англ. — joining). Особенность V-гена состоит в том, что изначально он не существует в геноме как целостная струк­тура. В разных участках ДНК содержатся его составляющие сегменты (V, D и J), представленные многими вариантами. Так, установлено, что V-группа содержит около 1000 сегментов, D-группа — 10, a J — 4 сегмента. Тем не ме­нее для построения антигенсвязывающего сайта рецептора достаточно ком­бинации всего трех сегментов — по одному из каждой из указанных групп. Богатый набор различных вариантов одного и того же сегмента обеспечивает чрезвычайно широкие возможности для генетических рекомбинаций, в ре­зультате которых и создается V-ген.

Рецептор антигенного распознавания В-лимфоцита состоит из двух це­пей — тяжелой и легкой, которые отличаются длиной, а значит — и моле­кулярной массой. В построении антигенсвязывающих участков принима­ют участие обе цепи, а конечную (хвостовую) часть константного участка формирует одна тяжелая цепь. Поэтому для синтеза рецептора необходимо создать по крайней мере два V-гена — для синтеза вариабельного участка тяжелой и легкой цепи. Как уже отмечалось ранее, изначально V-ген не су­ществует как целостная структура, а представлен разрозненными фрагмента­ми — V-, D- и J-сегментами, в которых содержится информация о строении вариабельных участков рецепторов.

Принцип формирования V-гена состоит в случайном выборе по одному сег­менту из каждой группы (V, D, J) и их пространственном сближении. При этом все участки ДНК, расположенные между выбранными сегментами, вырезают­ся. Сначала выбираются D- и J-сегменты, а потом к образованному комплек­су DJ присоединяется один из сегментов V-группы. Образованная последова­тельность V-D-J и является V-геном. Возникает вопрос: на каком основании происходит выбор сегментов из указанных групп для формирования V-гена? Ответ — случайно. Случайность выбора обеспечивается активацией специаль­ных ферментов — рекомбиназ, способных наугад выбирать по одному сегменту из каждой группы и присоединять их друг к другу. Установлено, что подобные ферменты синтезируются по крайней мере на двух генах (RAG₁ и RAG₂), ко­торые называются рекомбинант-активирующими. По функциям, которые вы­полняют ферменты, задействованные в создании V-гена, их можно разделить на нуклеазы (экзо- и эндо-), разрезающие цепи изнутри (эндонуклеазы) или с конца (экзонуклеазы), транcферазы, которые осуществляют перенос сегмен­тов или отдельных нуклеотидов, и лигазы, сшивающие компоненты новообра­зованных комбинаций, восстанавливая непрерывность нитей ДНК.

Как работают рекомбиназы? Сначала происходит пространственное сбли­жение случайно выбранных сегментов, в связи с чем участок ДНК, располо­женный между ними, собирается в складку, названную «петлей». После этого образованная петля приобретает стабильную конфигурацию, удерживая вы­бранные сегменты рядом друг с другом. Дело в том, что участки ДНК между группами сегментов V-гена содержат симметрично расположенные компле­ментарные друг другу зоны. В связи с симметричностью расположения при образовании петли такие зоны оказываются друг против друга, а благодаря комплементарности нуклеотидного состава — соединяются между собой по принципу замок-молния. Как только петля приобрела стабильную конфигура­цию, нуклеазы отрезают ее с обеих сторон, а лигазы объединяют выбранные сегменты V-гена, восстанавливая непрерывность цепи ДНК.

Поскольку количество V-сегментов является наибольшим, то случайный выбор именно сегмента этой группы главным образом и определяет разно­образие рецепторного репертуара. Кроме этого, V-сегменты являются наибо­лее длинными и кодируют около 95 аминокислотных остатков, в то время как комплекс DJ — не более 14. Поэтому большая часть вариабельного участка построена именно из продукта V-сегмента.

D-сегменты (от англ. — diversity) являются факторами дополнительного разнообразия. Реальное количество таких сегментов значительно увеличивается. Дело в том, что участок ДНК, где помещаются D-сегменты, может претерпевать транскрипцию в трех рам­ках считывания, одна из которых избирается случайно. При этом в условиях каждой рамки считывания полностью меняется содержание всех сегментов D-группы, то есть «возникают» новые сегменты. Это обусловлено триплетностью генетического кода. При смещении начала транскрипции лишь на один нуклеотид заново происходит условное перераспределение нити ДНК на трой­ки нуклеотидов, что изменяет состав всех триплетов, а значит, обуславливает дальнейший синтез полипептидной цепи принципиально нового аминокис­лотного состава.

J-группа мало влияет па формирование разнообразия рецеп­торного аппарата, поскольку содержит ограниченное количество сегментов.

Тем не менее именно эти сегменты соединяют вариабельный участок антитела с константным (отсюда к название).

За счет случайных комбинаций сегментов образуется огромное количество разнообразных V-генов. Если учесть, что в формировании целостного рецептора принимает участие еще и легкая цепь, также образованная согласно описанным принципам, то количество разнообразных антигенсвязывающих сайтов увеличи­вается до 10¹¹. Тем не менее даже такое количество разнообразных комбинаций является недостаточным для эффективного распознавания эпитопов всех воз­можных патогенов. Для расширения разнообразия привлекаются дополнительные случайные механизмы, которые изменяют структуру места соединения V- и D- сегментов (рис 22). Вследствие удаления участка ДНК, который находится между случайно выбранными V- и D-сегментами, нуклеиновая кислота разрывается на две нити-фрагмента. На концах обращенных друг к другу фрагментов и поме­шаются соответственно V- и D-сегмент. Высвобожденные концы очень ранимы, поскольку являются оголенными частями молекулы, а поэтому — потенциально чувствительны к деструктивным влияниям, что ставит под угрозу существова­ние ДНК. Для стабилизации молекулы ферменты репарации наугад достраива­ют короткие нуклеотидные последовательности к оголенным концам — по две с внутренних концов нитей-фрагментов, поскольку ДНК, как известно, является двухцепочечной молекулой. Потом достроенные последовательности замыкаются «сами на себя» за счет формирования 3^/-5^/-сложноэфирной связи между терминалями целей ДНК. При этом оголенные концы исчезают. Образованная конечная структура получила образное название шпильки. Однако шпильки препятству­ют восстановлению непрерывности ДНК, то есть соединению нитей-фрагментов между собой. Поэтому эндонуклеазы разрывают нуклеотидную последователь­ность в основе одной из ножек шпильки. За счет этого снова высвобождается оголенный конец одного из полинуклеотидных цепей нити-фрагмента, а конец второго оказывается прикрытым полинуклеотидной достройкой двойной длины. На терминале второй нити происходят подобные изменения. Затем происходит репликация достроек на обеих нитях-фрагментах и соединение последних. Поэто­му между V- и D-сегментами при соединении оказываются два участка случайных последовательностей (Р-фрагменты), которые определенным образом изменяют структуру будущего V-гена. Более того, во время объединения нитей-фрагмен­тов специальный фермент дезоксирибонуклеотидилтрансфераза успевает наугад встроить в место соединения еще несколько нуклеотидов, что приводит к даль­нейшим изменениям в V-гене. Именно таким образом между P-фрагментами фор­мируется N-фрагмент случайного состава — результат деятельности указанной транcферазы. Поэтому при формировании вариабельных участков рецепторов параллельно с комбинационными происходят и определенные мутационные из­менения (случайные последовательности и встроенные нуклеотиды), за счет кото­рых новообразованный V-ген не является простой суммой V-, D- и J-сегментов (рис. 22). Материал с сайта http://wiki-med.com

После того как V-ген сформирован, процессы рекомбинации ДНК при­останавливаются, и начинается транскрипция новообразованной последовательности нуклеотидов, которая включает собственно V-ген, незадействованные сегменты V- и J-групп, сохранившиеся при сращении цепей, а также — все С-сегменты. При этом получается первичная РНК. В дальнейшем первич­ная РНК претерпевает сплайсинг («созревание») — все ее С-сегменты и незадействованные V- и J-сегменты вырезаются, а остается лишь V-ген и Cμ. При этом первичная РНК превращается в РНК-предшественницу. В процес­се трансляции на такой РНК-предшественнице будет сформирована тяже­лая цепь будущею рецептора, который появится на поверхности лимфоцита вместе с суррогатной цепью. Последняя кодируется генами, которые не пре­терпевают перестройку. Экспрессия такого антигенраспознающего рецеп­тора необходима иммунокомпетентной клетке для взаимодействия с микро­окружением и дальнейшего выживания. Дело в том, что взаимодействие с эпителиальными клетками, составляющими микроокружение, препятству­ет спонтанному апоптозу лимфоцита. Это означает, что выживают только те иммунокомпетентные клетки, которые способны распознавать структуры собственного организма. На этом этапе выбраковываются лимфоциты, содер­жащие дефектные антигенсвязывающие участки тяжелых цепей. Поскольку процессы рекомбинации происходят наугад, клеток с такими рецепторами бу­дет довольно много. В дальнейшем в процесс рекомбинации будут привлече­ны гены легких цепей антитела, которые и сменят суррогатные цепи на по­верхности клетки. Следует отметить, что V-ген легкой цепи формирует лишь V- и J-сегменты. Таким образом, получается первичный антигенраспознающий рецептор В-лимфоцита — IgM-мономер (рис. 23).

По мере созревания В-лимфоцит начинает экспрессировать IgD-рецептор. Синтез других рецепторов происходит лишь во время реализации иммунного ответа, поскольку для этого необходимо соответствующее цитокиновое влияние и контакт с активированным Т-лимфоцитом. Переключение на синтез антител другого класса происходит за счет использования других С-сегментов, что при­водит к изменению нуклеотидных последовательностей не в информационной РНК, как это было при созревании клетки, а на уровне ДНК. При этом снова активируются нуклеазы, выделяющие и приобщающие один из С-сегментов (со­ответственно цитокиновому профилю) к комплексу VDJ. Все другие С-сегменты, расположенные в цепи по правую сторону от избранного, вырезаются и на­всегда утрачиваются В-лимфоцитом. Поэтому В-клетка не способна синтезиро­вать, например, иммуноглобулин М после иммуноглобулина G, поскольку при синтезе последнего был утрачен сегмент Cμ, кодирующий константный участок IgM и находящийся по правую сторону от любого из Сγ сегментов. Но вполне естественным будет переход, в частности, с синтеза IgM на синтез IgG₁ Таким образом, В-лимфоцит, который синтезирует IgA₂, уже не может синтезировать ни одного другого антитела, поскольку безвозвратно утратил все С-сегменты, кроме Сα₂. Теперь мы можем объяснить, почему во время созревания В-клетки присоединение С-сегмента происходит на уровне РНК и синтезируется именно IgM. Сохранение всех С-сегментов ДНК позволяет В-лимфоциту в дальнейшем продуцировать любой класс антител. При этом все антитела данной В-клетки независимо от их класса будут содержать одинаковые антигенсвязывающие сай­ты, поскольку все разнообразие V-, D- и J-сегментов утрачено еще в период созревания. Изменяется лишь экспрессия С-сегментов (рис. 24).